Ojutu fun Wiwa Endotoxin ninu Ẹran Malu Oyun
Ojutu fun Wiwa Endotoxin ninu Ẹran Malu Oyun
BETMATÀpilẹ̀kọ àti Pàtàkì Pàtàkì Ṣíṣàwárí Endotoxin
Ìṣàn Ẹranko Fetal (FBS), gẹ́gẹ́ bí àfikún adánidá tí a ń lò jùlọ nínú àṣà sẹ́ẹ̀lì, ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn èròjà amuaradagba, àwọn ohun tí ó ń fa ìdàgbàsókè, àwọn homonu, àwọn vitamin, àti àwọn èròjà pàtàkì mìíràn fún ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì. Ó ń kó ipa tí kò ṣeé yípadà nínú àwọn ẹ̀ka bí ìwádìí nípa ẹ̀dá sẹ́ẹ̀lì, àwọn oògùn biopharmaceuticals, àti ìtọ́jú sẹ́ẹ̀lì. Síbẹ̀síbẹ̀, FBS ní ìfaradà púpọ̀ sí ìbàjẹ́ endotoxin jákèjádò gbogbo ẹ̀ka iṣẹ́ títí bí gbígbà, ṣíṣe, pípínyà, ìfipamọ́, àti gbígbé.
Endotoxin (Lipopolysaccharide, LPS), apakan ti ogiri sẹẹli ti kokoro arun Gram-negative, le fa ipalara nla si eto asa sẹẹli ati awọn ohun elo isalẹ ni kete ti o ba wọ inu FBS:
1. Bíbo ìdúróṣinṣin àṣà sẹ́ẹ̀lì jẹ́: Endotoxin lè mú àwọn ipa ọ̀nà ìfàmìsí ṣiṣẹ́ bíi Toll-like receptor 4 (TLR4) lórí ojú sẹ́ẹ̀lì, èyí tí ó ń mú kí àwọn sẹ́ẹ̀lì tú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ohun tí ó ń fa ìgbóná ara jáde bíi tumor necrosis factor-α (TNF-α) àti interleukin-1 (IL-1). Èyí ń dí ìbísí, ìyàtọ̀, àti ìṣiṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì lọ́wọ́, èyí tí ó ń yọrí sí àwọn ìyípadà nínú ìrísí sẹ́ẹ̀lì, ìdènà ìdàgbàsókè, àti àní apoptosis sẹ́ẹ̀lì, èyí tí ó ń yọrí sí ìkùnà àwọn àyẹ̀wò àṣà sẹ́ẹ̀lì.
2. Ní ipa lórí ìpéye àwọn àbájáde ìwádìí: Fún àwọn àyẹ̀wò tí ó gbára lé àwọn àpẹẹrẹ sẹ́ẹ̀lì, bí ìṣàyẹ̀wò oògùn àti ìdàgbàsókè àjẹsára, ìdáhùn ìdààmú sẹ́ẹ̀lì tí endotoxin ń fà lè fa
Bojú tàbí dí àwọn ipa gidi ti àwọn oògùn ìwádìí, èyí tí ó lè yọrí sí àwọn àbájáde èké-rere tàbí èké-odi, tí ó sì lè nípa lórí ìgbẹ́kẹ̀lé àwọn ìwádìí. 3. Fífi ààbò àwọn ọjà ìbílẹ̀ sínú ewu: Nínú iṣẹ́ àwọn oògùn ìbílẹ̀, a sábà máa ń lo FBS nínú ṣíṣe àwọn ọjà ìbílẹ̀ bíi àwọn protein recombinant àti àwọn èròjà monoclonal. Tí iye endotoxin nínú ẹ̀jẹ̀ bá ju ìwọ̀n lọ, endotoxin yóò wọ inú ọjà ìkẹyìn nígbà iṣẹ́ ìṣẹ̀dá. Nígbà tí a bá lo ọjà náà ní ìṣègùn, ó lè fa àwọn ìṣesí pyrogenic líle nínú àwọn aláìsàn, bíi ibà, otútù, àti ìjayà, èyí tí ó lè fi ẹ̀mí àwọn aláìsàn sínú ewu. Nítorí náà, ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìlànà àṣẹ bíi pharmacopoeia, wíwá endotoxin ti FBS ṣe pàtàkì nínú ṣíṣàkóso dídára ẹ̀jẹ̀, rírí i dájú pé ìwọ̀n àṣeyọrí ti àṣà sẹ́ẹ̀lì ni ó wà, àti rírí ààbò àwọn ọjà ìbílẹ̀.
Ọ̀nà Ìwádìí | Ìlànà | Àwọn àǹfààní | Àwọn Àléébù | Àwọn Ìṣẹ̀lẹ̀ Tó Wúlò |
Ọ̀nà Jeli-Clot | Endotoxin n mu ipa ọna serine protease zymogen ti Factor C ṣe ni LAL ṣiṣẹ, o si n ṣe iranlọwọ fun iyipada coagulogen si jeli kan. | Iṣẹ́ tó rọrùn; kò sí ohun èlò ìwádìí endotoxin tó gbowólórí tí a nílò. | Wiwa idanimọ oniye tabi oniye-oṣuwọn nikan ni o ṣeeṣe, ati pe a ko le ṣe iṣiro deede. Akoko wiwa gigun (iṣẹju 60). | Àyẹ̀wò tó péye àti ìṣàwárí ìdámẹ́rin-ìṣirò àkọ́kọ́ ti endotoxin nínú ẹ̀jẹ̀ ẹran màlúù. |
Ọ̀nà Ìlànà Ìwà-bí-ẹlẹ́sẹ̀-ńlá Kinetic | Ó ń ṣe àkíyèsí ìyípadà nínú ìdàrúdàpọ̀ nígbà ìṣiṣẹ́ láàrín LAL àti endotoxin, ó sì ń ṣírò ìṣọ̀kan náà ní ìbámu pẹ̀lú àkókò ìṣiṣẹ́ náà. | Ìwọ̀n tó péye; iyàrá ìwádìí tó yára díẹ̀ (30-120 ìṣẹ́jú); | O nilo lilo awọn ẹrọ wiwa endotoxin. | Wiwa iye pipe ti endotoxin ninu serum malu. |
Ọ̀nà Kinetic Chromogenic | Àwọn ẹgbẹ́ chromogenic ni a máa ń tú jáde nígbà tí a bá ń ṣe ìhùwàpadà náà, a sì máa ń ṣírò ìṣọ̀kan náà ní ìbámu pẹ̀lú ìyípadà nínú ìfàmọ́ra. | Ìfàmọ́ra gíga; ìpele tí ó gbòòrò; agbára ìdènà ìdènà líle. | Iye owo giga ti awọn ohun elo ati awọn reagents. | Àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ tó nílò ìfàmọ́ra gíga (fún àpẹẹrẹ, omi ara fún ìtọ́jú sẹ́ẹ̀lì). |
Àwọn àbá fún yíyan ọ̀nà: Fún ìṣàkóso dídára FBS déédéé, a lè lo àpapọ̀ "àyẹ̀wò àkọ́kọ́ nípasẹ̀ Gel-Clot Method + quantification by Kinetic Turbidimetric Method tàbí Kinetic Chromogenic Method". Fún àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ tí ó ní àwọn ìbéèrè gíga lórí ìpele endotoxin, bíi ìtọ́jú sẹ́ẹ̀lì àti biopharmaceuticals, a gbani nímọ̀ràn Ọ̀nà Kinetic Chromogenic láti rí i dájú pé a rí i pé ó ní ìmọ̀lára àti pé ó péye.
Boṣewa Ìwádìí Endotoxin Ilana (Gbígbé "Àyẹ̀wò Àkọ́kọ́ nípasẹ̀ Ọ̀nà Gel-Clot + Ìwọ̀n nípasẹ̀ Ọ̀nà Kinetic Turbidimetric" gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ)
3.1 Àpẹẹrẹ Ìtọ́jú Àkọ́kọ́
FBS ní àkójọpọ̀ tó díjú (tó ní àwọn èròjà protein, lipids, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ), àti wíwá tààràtà lè dí ìṣe LAL lọ́wọ́, nítorí náà a nílò ìtọ́jú ṣáájú:
1. Àpẹẹrẹ Yíyọ́: Jẹ́ kí FBS tí ó ti dì ...
2. Ìtọ́jú Ìpara: Fi omi ìpara pò omi ìpara náà (nígbà gbogbo ìgbà 10-100) nípa lílo omi ìpara LAL. Ó yẹ kí a pinnu ohun tí ó ń fa ìpara náà ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n endotoxin tí a retí nínú omi ìpara náà àti ìfàmọ́ra LAL reagent láti rí i dájú pé ìpele àyẹ̀wò tí a ti pò náà wà láàrín ìwọ̀n ìlà tí a ti ń rí i àti láti dín ìdènà omi ìpara dúdú kù lórí wíwá endotoxin.
3. Ìmọ́lẹ̀ centrifugal: Tí àyẹ̀wò tí a ti pò mọ́lẹ̀ bá ṣì rúdurùdu, fi centrifuge sí i ní 4°C àti 3000 rpm fún ìṣẹ́jú 10-15, kí o sì mú supernatant náà gẹ́gẹ́ bí àyẹ̀wò tí a fẹ́ dán wò.
3.2 Igbaradi awọn ohun elo ati ohun elo
1. Yíyan àti Ìfìdíkalẹ̀ Reagent:
- Limulus Amebocyte Lysate (LAL): Gẹ́gẹ́ bí ààlà endotoxin ti serum (tó sábà máa ń nílò ≤0.06 EU/mL tàbí ≤0.125 EU/mL), yan Gel-Clot Method LAL reagent pẹ̀lú ìfàmọ́ra ti 0.03 EU/mL àti Kinetic Turbidimetric Method LAL reagent pẹ̀lú ìfàmọ́ra tó báramu. Ìdánilójú ìfàmọ́ra ni a nílò fún gbogbo àwọn reagent kí a tó lò ó.
- Ipele Endotoxin: Iṣakoso Standard Endotoxin (CSE) tabi Ipele Reference Standard Endotoxin (RSE), ti a ti dapọ mọ awọn ifọkansi gradient pẹlu Omi Reagent LAL, ti a lo fun scheming boṣewa curve ati iṣakoso rere.
- Ohun tí a fi ń ṣe àtúnṣe LAL Omi: Àkóónú Endotoxin tí kò tó 0.005 EU/mL.
2. Ìyọkúrò Ẹ̀rọ: Gbogbo ẹ̀rọ tó bá fara kan àwọn àyẹ̀wò àti àwọn ohun èlò ìṣàpẹẹrẹ (pipettes, centrifuge tubes, reaction tubes, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ) gbọ́dọ̀ wà láìsí endotoxin. A gbọ́dọ̀ fi gíláàsì tọ́jú ẹ̀rọ náà ní ooru gbígbẹ ní 250°C fún ju ìṣẹ́jú 30 lọ. Tàbí kí a lo ẹ̀rọ tí kò ní endotoxin tí a lè jù nù láti yẹra fún àbàwọ́n.
3.3 Iṣẹ́ Àyẹ̀wò Àkọ́kọ́ nípa lílo Ọ̀nà Gel-Clot
1. Àyẹ̀wò Tí A Ń Fi Sílẹ̀: Fi àwọn ohun èlò wọ̀nyí kún àwọn páìpù ìhùwàpadà tí kò ní pyrogen lẹ́sẹẹsẹ:
- Àwọn Àpẹẹrẹ Ìdánwò: 0.1 mL ti a ti dapọ ninu omi ara + 0.1 mL ti a ti dapọ ninu omi ara ti a ti dapọ ninu omi ara ti a ti dapọ ninu omi ara;
- Awọn Iṣakoso odi: 0.1 mL LAL Reagent Omi + 0.1 mL LAL reagent;
- Awọn Iṣakoso Rere: 0.1 mL 2λ ojutu endotoxin boṣewa (λ = ifamọ reagent LAL) + 0.1 mL reagent LAL;
- Fún Ìdánilójú Ìmọ̀lára: 0.1 mL boṣewa endotoxin ti awọn ifọkansi oriṣiriṣi + 0.1 mL LAL reagent.
Lẹ́yìn tí a bá ti kó àwọn àyẹ̀wò jọ, dapọ̀ mọ́ra díẹ̀díẹ̀ kí ó má baà mú kí àwọn nọ́ńbà jáde.
2. Ìmúdàgba: Fi àwọn páìpù sínú omi ìwẹ̀ ní 37±1°C kí o sì fi sínú iná fún ìṣẹ́jú 60±2, láìsí gbígbìgì tí a gbà láyè ní àkókò yìí.
3. Ìdájọ́ Àbájáde: Lẹ́yìn ìfàsẹ́yìn, fi pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ yọ àwọn ọ̀pọ́ náà jáde kí o sì yí wọn padà díẹ̀díẹ̀ ní 180°. Tí gẹ́lì náà bá wà ní ipò tí ó yẹ, tí kò sì ṣàn, ó jẹ́ rere (endotoxin ≥ LAL reagent sensitivity); tí gẹ́lì náà bá fọ́ tàbí tí ó farahàn bí omi, ó jẹ́ odi (endotoxin
3.4 Ìwádìí Oníṣirò Nípasẹ̀ Ọ̀nà Kinetic Turbidimetric
Fún àwọn àyẹ̀wò tí kò ní èròjà nínú ìṣàyẹ̀wò àkọ́kọ́ nípasẹ̀ Gel-Clot Method tàbí tí ó nílò ìwọ̀n pípéye, a lo Kinetic Turbidimetric Method fún wíwá:
1. Ìkọ́lé Ìwọ̀n Àṣàyàn: Tú endotoxin boṣewa sí àwọn ìfọ́pọ̀ gradient tó ju mẹ́rin lọ (fún àpẹẹrẹ, 0.01 EU/mL, 0.1 EU/mL, 1 EU/mL, 10 EU/mL), da ọ̀kọ̀ọ̀kan pọ̀ mọ́ LAL reagent, fi kún àwo 96-well plate kan, gbé e sínú kinetic incubating microplate reader, fi sínú iná ní 37°C, kí o sì kọ àkókò ìṣesí (àkókò tí turbidity yóò fi dé ibi tí ó yẹ) tí ó bá ìfọ́pọ̀ kọ̀ọ̀kan mu. Fi ìlà ìpele àṣàyàn náà sí: log10 Y= B(ìwé ìkọ̀wé10 X) + A, níbi tí Y= àkókò ìṣesí, X= ìfojúsùn endotoxin, B = ìtẹ̀sí ìlà ìtẹ̀síwájú, A= ìdènà Y. (R² gbọ́dọ̀ jẹ́ ≥0.98).
2. Ṣíṣàyẹ̀wò Àyẹ̀wò: Da àyẹ̀wò ẹ̀jẹ̀ tí a ti pò pọ̀ mọ́ra láti fi LAL reagent dán an wò, fi kún microplate náà dáadáa, ṣe àwárí lábẹ́ àwọn ipò kan náà, ṣàkọsílẹ̀ àkókò ìṣesí náà, gẹ́gẹ́ bí ìlà ìtẹ̀síwájú láti ṣírò ìṣọ̀kan endotoxin ti àyẹ̀wò náà.
3. Àtúnṣe Àbájáde: Ṣírò ìṣọ̀kan endotoxin nínú ẹ̀jẹ̀ tí a kò ti pò mọ́ gẹ́gẹ́ bí àpẹẹrẹ ìdínkù omi.
awọn ẹya ara ẹrọ
1. Àwọn ìlànà fún ìdájọ́ àbájáde: A pinnu ààlà endotoxin ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìlànà ilé-iṣẹ́ àti àwọn ipò ìlò. Àwọn ìlànà ìdájọ́ tí a wọ́pọ̀ ni wọ̀nyí:
- FBS ìpele ìwádìí: Endotoxin ≤0.125 EU/mL;
- FBS ti o ni ipele oogun biopharmaceutical: Endotoxin ≤0.06 EU/mL;
- FBS-ipele itọju sẹẹli: Endotoxin ≤0.03 EU/mL.
Tí àbájáde ìwádìí náà bá kéré sí ààlà, a kà á sí ẹni tó yẹ;
tí ó bá ga ju ààlà lọ, kò péye, àti pé ó ṣeé ṣe láti tọ́pasẹ̀ síwájú sí i.
ti orisun idoti (bii ilana gbigba, awọn ohun elo iṣiṣẹ, awọn apoti ipamọ, ati bẹbẹ lọ) ni a nilo.
2. Àwọn Ohun Tí A Nílò fún Àkóónú Ìròyìn: Ìròyìn ìwádìí náà yẹ kí ó ní àwọn ìwífún pàtàkì wọ̀nyí:
- Àlàyé Àyẹ̀wò: Nọ́mbà ìpele omi ara, orísun rẹ̀, ọjọ́ tí a ṣe é, àkókò yíyọ́ rẹ̀;
- Ìwífún nípa Ìwádìí: Ọ̀nà ìwádìí, ìfàmọ́ra ti ohun èlò LAL, àwòṣe ohun èlò, ọjọ́ ìwádìí;
- Dátà Àbájáde: Iye ìwádìí àtilẹ̀bá, okùnfà ìyọkúrò, àbájáde ìṣirò, ìwọ̀n ààlà;
- Ìwífún nípa Ìṣàkóso Dídára: Ìṣàkóso odi, ìṣàkóṣo rere, ìṣọ̀kan ìbáramu (R²) ti ìtẹ̀sí boṣewa;
- Ìparí àti Ìfọwọ́sowọ́pọ̀: Sọ àbájáde ìdájọ́ náà ní kedere, pẹ̀lú ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ẹni tí ó dán an wò àti olùṣàyẹ̀wò.
Àwọn Àbá Ìtọ́pasẹ̀ Ìbàjẹ́ àti Ìdàgbàsókè Dídára
Tí ó bá jẹ́ pé wiwa endotoxin ti FBS ko peye, o jẹ dandan lati tọpa orisun idoti jakejado gbogbo ilana iṣelọpọ ati mu awọn ọna ilọsiwaju:
1. Ìṣàkóso Orísun: Yan àwọn olùpèsè tí wọ́n ní ìmọ̀, kí wọ́n ní kí wọ́n pèsè àwọn ìwé ẹ̀rí ìlera màlúù àti àkọsílẹ̀ ìdènà àrùn nígbà tí wọ́n bá ń kó ẹran jọ, kí wọ́n sì yẹra fún ríra àwọn ohun èlò ìtọ́jú ẹran láti àwọn agbègbè tí àjàkálẹ̀ àrùn tàbí ìbàjẹ́ ti pọ̀ sí.
2. Ipele ilana: Mu awọn ilana pipin ati sisẹ serum dara si (bii lilo awọn awo ultrafiltration 0.1 μm fun sisẹ), ati ṣe deedee imunadoko ooru gbigbẹ tabi ipakokoro kemikali lori awọn ohun elo iṣiṣẹ (bii awọn centrifuges, awọn tanki ti n ru erogba).
3. Ifipamọ́ àti Ìrìnnà: Lo àwọn ìgò gilasi tí kò ní ìfọ́mọ́ àti pyrogen tàbí àwọn àpò ike pàtàkì fún ìfipamọ́, ṣàkóso ìwọ̀n otútù ìfipamọ́ tí ó wà ní ìsàlẹ̀ -20°C, kí o sì lo ìrìnnà ẹ̀wọ̀n tútù nígbà ìrìnnà láti yẹra fún ìbàjẹ́ àpótí tàbí ìdàgbàsókè àwọn kòkòrò àrùn tí ìyípadà ìwọ̀n otútù ń fà.
4. Ìṣàkóso Yàrá fún idanwo endotoxin kokoro arun: Ṣe agbekalẹ eto idanimọ dandan fun omi ara ṣaaju ki o to fipamọ, kọ awọn ipele ti ko yẹ patapata, ki o si ṣe abojuto ibajẹ endotoxin ti ẹrọ iwadii yàrá ati ayika nigbagbogbo.